ICS 65.020.30 CCS B 40 33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2481—2022 畜禽排泄物中磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of sulfonamides residues in livestock and poultry excreta —Liquid chromatography–tandem mass spectrometry 2022-04-16 发布 2022-05-16 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 2481—2022 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、绿城农科检测技术有限公司。 本标准主要起草人：黄娟、裘丞军、王彬、罗成江、陈洁、侯轩、陈晓林、阮鑫、周蕾、赵月均、 任玉琴。 I DB33/T 2481—2022 畜禽排泄物中磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了畜禽排泄物中磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧 啶、磺胺二甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺甲噻二唑、苯甲酰磺胺、磺胺二甲嘧啶、磺胺异嘧啶、磺胺对甲 氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺喹噁啉、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲 氧嘧啶、磺胺苯吡唑的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于畜禽排泄物中上述20种磺胺类药物残留量的测定。 本标准的检出限为2 g/kg，定量限为5 g/kg。 注： 畜禽排泄物包括畜禽排泄的粪便或粪便和尿液的混合物。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过规范性文件的引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 25169 畜禽监测技术规范 3 术语和定义 本标准没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中残留的磺胺类药物经酸化乙腈溶液提取，氮气吹干后用磷酸盐溶液复溶，固相萃取柱净化， 液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。 5 试剂或材料 除非另有规定，均使用分析纯试剂。 5.1 水：GB/T 6682，一级。 5.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 5.3 正己烷（C6H14）。 5.4 90 %酸化乙腈溶液：取 900 mL 乙腈，加冰乙酸 10 mL，加水稀释至 1 000 mL，混匀。 5.5 0.05 mol/L 磷酸盐溶液：取 1.48 g 磷酸二氢钠和 14.50 g 磷酸氢二钠，加水溶解稀释至 1 000 mL, 混匀。 5.6 5 %甲醇溶液：取 50 mL 甲醇，加水稀释至 1 000 mL，混匀。 5.7 5 %氨化甲醇：取 5 mL 氨水，加甲醇稀释至 100 mL，混匀。 1 DB33/T 2481—2022 5.8 0.1 %甲酸溶液：取 1.0 mL 甲酸，加水稀释至 1 000 mL，混匀。 5.9 乙腈甲酸溶液：取 10 mL 乙腈，用 0.1 %甲酸溶液稀释至 100 mL，混匀。 5.10 0.1%甲酸甲醇溶液：取 1.0 mL 甲酸，加甲醇稀释至 1 000 mL，混匀。 5.11 磺胺类标准品：各标准品信息见附录 A，纯度≥95 %。 5.12 标准贮备溶液(1 mg/mL)：分别称取磺胺类标准品（5.11)约 10 mg（准确至 0.01 mg），分别置 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇（5.2）溶解并定容至刻度，混匀。-20 ℃以下保存，有效期 6 个月。 5.13 混合标准中间溶液Ⅰ(10 g/mL)：分别吸取标准贮备溶液（5.12）各 1.00 mL，置于 100 mL 棕色 容量瓶中，用甲醇（5.2）稀释至刻度，混匀，-20 ℃以下保存，有效期 1 个月。 5.14 混合标准中间溶液Ⅱ(250 ng/mL)：准确吸取混合标准中间溶液Ⅰ（5.13）250 L，置于 10 mL 棕 色容量瓶中，用乙腈甲酸溶液（5.9）稀释至刻度，混匀，现用现配。 5.15 系列混合标准工作溶液：准确吸取混合标准中间溶液Ⅱ（5.14）适量，用乙腈甲酸溶液（5.9） 稀释成浓度为 2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL、250.0 ng/mL 的系列标准 工作溶液，现用现配。 5.16 N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯混合固相萃取柱（HLB）：60 mg/3 mL 或性能相当者。 5.17 微孔滤膜：0.22 m，水系。 6 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 6.11 液相色谱－串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 分析天平：感量 0.01 mg、0.01 g。 真空冷冻干燥机：冷阱温度-50 ℃，真空度 10 Pa。 离心机：转速不低于 10 000 r/min。 氮吹仪。 固相萃取装置。 振荡仪。 涡旋混合器。 超声提取仪。 样品粉碎设备。 分析筛：0.5 mm 孔径。 7 样品制备与保存 按照GB/T 25169采集畜禽排泄物，用四分法缩减至约200 g，-40 ℃以下真空冷冻干燥24 h，使样品 中的水分在10 %以下，粉碎，过0.5 mm孔径的分析筛（6.11），装入密闭容器中，于-20 ℃以下保存备 用。 取不含待测磺胺类药物的样品适量，按上述方法制备，作为空白试样。 8 测定步骤 8.1 试样溶液制备 8.1.1 提取 2 DB33/T 2481—2022 将装有试样的密闭容器取出，放至室温。称取试样约2 g（精确到0.01 g），置于50 mL离心管中， 准确加入90 %酸化乙腈溶液（5.4）10.0 mL，涡旋使试样分散，振荡10 min，超声提取10 min，10 000 r/min 离心5 min。准确移取上清液2 mL，置于10 mL试管中，加入0.05 mol/L磷酸盐溶液（5.5）1 mL，混匀， 于30 ℃水浴中氮气吹至残余物小于1 mL。再加入0.05 mol/L磷酸盐溶液（5.5）3 mL、正己烷（5.3）2 mL， 涡旋1 min、超声2 min，使残余物溶解，静置分层或10 000 r/min离心2 min，取下层水相备用。 8.1.2 净化 取HLB固相萃取柱（5.16），依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取全部备用液（8.1.1）过柱，控制流 速在1.0 mL/min以下，依次用水3 mL，5 %甲醇溶液（5.6）3 mL淋洗，抽干。用5 %氨化甲醇（5.7）3 mL 洗脱，收集洗脱液，30 ℃水浴中氮气吹干，加乙腈甲酸溶液（5.9）1.00 mL，超声2 min、涡旋60 s使残 余物溶解，溶液经0.22 m微孔滤膜（5.17）过滤，上机测定。 8.2 基质匹配混合标准曲线的制备 称取空白试样约2 g（精确至0.01 g），按8.1步骤操作，氮气吹干后分别准确加入系列混合标准工 作溶液（5.15）1.00 mL，混合溶解后经微孔滤膜（5.17）过滤，制成2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、25.0 ng/mL、 50.0 ng/mL、100.0 ng/mL、250.0 ng/mL的基质匹配系列标准溶液，用液相色谱－串联质谱仪测定。以 特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、标准工作溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线，求回归方程 和相关系数。 8.3 液相色谱-质谱参考条件 8.3.1 液相色谱参考条件 色谱柱：C18柱，柱长50 mm，内径2.1 mm，粒度1.7 m，或性能相当者。 柱温：35 ℃。 进样量：5 L。 流动相：A：0.1 %甲酸溶液（5.8）；B：0.1 %甲酸甲醇溶液（5.10），梯度洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 时间 min 流速 mL/min A % B % 0.0 0.3 95 5 2.0 0.3 85 15 5.0 0.3 60 40 7.0 0.3 5 95 7.1 0.3 95 5 11.0 0.3 95 5 8.3.2 质谱参考条件 离子化模式：电喷雾离子源（ESI），正离子多反应监测模式（MRM）。 喷雾电压：1.0 kV。 源温：150 ℃。 雾化温度：450 ℃。 雾化气流速：1 000 L/h。 锥孔气流速：30 L/h。 3 DB33/T 2481—2022 碰撞气：氩气。 定性、定量离子对及锥孔电压和碰撞能量参考值见表2。 表2 定性、定量离子对及锥孔电压和碰撞能量参考条件 名称 磺胺醋酰 磺胺吡啶 磺胺嘧啶 磺胺甲噁唑 磺胺噻唑 磺胺甲基嘧啶 磺胺二甲噁唑 磺胺异噁唑 磺胺甲噻二唑 苯甲酰磺胺 磺胺二甲嘧啶 磺胺异嘧啶 磺胺对甲氧嘧啶 磺胺甲氧哒嗪 磺胺间甲氧嘧啶 磺胺氯哒嗪 磺胺喹噁啉 定性离子对 m/z 215.1＞156.1 215.1＞108.1 250.2＞156.1 250.2＞108.1 251.2＞156.1 251.2＞108.1 254.1＞156.1 254.1＞108.1 256.3＞156.1 256.3＞108.1 265.2＞156.1 265.2＞172.1 268.2＞156.1 268.2＞113.1 268.2＞156.1 268.2＞113.1 271.2＞156.1 271.2＞108.1 277.1＞156.1 277.1＞108.1 279.2＞186.1 279.2＞124.1 279.2＞124.2 279.2＞186.1 281.2＞156.1 281.2＞126.2 281.2＞156.1 281.2＞126.2 281.2＞156.1 281.2＞126.2 285.2＞156.1 285.2＞108.1 301.1＞156.1 301.1＞108.1 磺胺邻二甲氧嘧 311.1＞156.1 啶 311.1＞108.1 4 定量离子对 m/z 215.1＞156.1 250.2＞156.1 251.2＞156.1 254.1＞156.1 256.3＞156.1 265.2＞156.1 268.2＞156.1 268.2＞156.1 271.2＞156.1 277.1＞156.1 279.2＞18