ICS 65.020.30 CCS B 40 33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2482—2022 畜禽排泄物中喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of quinolones residues in livestock and poultry excreta —Liquid chromatography–tandem mass spectrometry 2022-04-16 发布 2022-05-16 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 2482—2022 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、绿城农科检测技术有限公司。 本标准主要起草人：裘丞军、侯轩、钟寒辉、陈凯、王彬、陈勇、孙冰冰、蔡文金、何晓明、倪娟 桢、吴望君、任玉琴。 I DB33/T 2482—2022 畜禽排泄物中喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了畜禽排泄物中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、洛美沙星、奥比沙星、双 氟沙星、沙拉沙星、恶喹酸、依诺沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟甲喹、培氟沙星、马波沙星的液相色 谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于畜禽排泄物中上述15种喹诺酮类药物残留量的测定。 本标准的检出限为5 g/kg，定量限为10 g/kg。 注： 畜禽排泄物包括畜禽排泄的粪便或粪便和尿液的混合物。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过规范性文件的引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 25169 畜禽监测技术规范 3 术语和定义 本标准没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中残留的喹诺酮类药物用N,N-二甲基甲酰胺和0.1 mol/L盐酸溶液提取，用固相萃取柱净化， 液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。 5 试剂或材料 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 除非另有规定，均使用分析纯试剂。 水：GB/T 6682，一级。 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 N,N-二甲基甲酰胺（HCON(CH3)2）。 0.1 mol/L 盐酸溶液：量取 9 mL 盐酸，注入 1 000 mL 水中，摇匀。 5 %甲醇溶液：量取 5 mL 甲醇，加水至 100 mL，摇匀。 0.1 %甲酸溶液：量取 1.0 mL 甲酸，加水至 1 000 mL，摇匀。 乙腈甲酸溶液：取 10 mL 乙腈，用 0.1 %甲酸溶液稀释至 100 mL, 混匀。 0.1 %甲酸甲醇溶液：量取 1.0 mL 甲酸，加甲醇（5.2）至 1 000 mL，摇匀。 喹诺酮类标准品：各标准品信息见附录 A，纯度均≥95 %。 1 DB33/T 2482—2022 5.10 标准储备溶液（100 g/mL）：分别称取喹诺酮类标准品（5.9）约 10 mg（准确至 0.01 mg），分 别置 100 mL 容量瓶中，加 5 mLN,N-二甲基甲酰胺（5.3）超声使溶解，用甲醇（5.2）稀释至刻度，混 匀。-20 ℃以下避光保存，有效期 3 个月。 5.11 混合标准中间工作溶液（1 g/mL）：分别移取标准储备溶液（5.10）各 1.00 mL，置 100 mL 容 量瓶中，用甲醇（5.2）稀释至刻度，混匀。-20 ℃以下避光保存，有效期 1 个月。 5.12 混合系列标准工作溶液：准确移取混合标准中间工作溶液（5.11）适量，用乙腈甲酸溶液（5.7） 稀释成浓度为 2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL 的混合系列标准工作溶液， 现配现用。 5.13 N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯混合固相萃取柱（HLB）：60 mg/3 mL，或性能相当者。 5.14 微孔滤膜：0.22 m，水系。 6 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 6.11 液相色谱－串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 分析天平：感量 0.01 mg、0.01 g。 真空冷冻干燥机：冷阱温度-50 ℃，真空度 10 Pa。 离心机：转速不低于 10 000 r/min。 氮吹仪。 固相萃取装置。 振荡仪。 涡旋混合器。 超声提取仪。 样品粉碎设备。 分析筛：0.5 mm 孔径。 7 样品制备与保存 按照GB/T 25169采集畜禽排泄物，用四分法缩减至约200 g，-40 ℃以下真空冷冻干燥24 h，使样品 中的水分在10 %以下，粉碎，过0.5 mm孔径的分析筛（6.11），装入密闭容器中，于-20 ℃以下保存备 用。 取不含待测喹诺酮类药物的样品适量，按上述方法制备，作为空白试样。 8 测定步骤 8.1 提取 将装有试样的密闭容器取出，放至室温。称取试样约2 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中， 加N,N-二甲基甲酰胺（5.3）5.0 mL，涡旋1 min，使试样完全分散、浸湿，再加0.1 mol/L盐酸溶液（5.4） 5.0 mL，振荡10 min，常温水浴超声10 min，10 000 r/min离心5 min，收集上清液至另一50 mL离心管中； 沉淀物用5.0 mL N,N-二甲基甲酰胺（5.3）和5.0 mL 0.1 mol/L盐酸溶液（5.4）重复提取一次，合并上 清液，混匀，10 000 r/min离心5 min，移取上清液2.00 mL，用0.1 mol/L盐酸溶液（5.4）稀释至20 mL， 混匀，备用。 8.2 净化 2 DB33/T 2482—2022 取HLB固相萃取柱（5.13），依次用甲醇3 mL、水3 mL活化，取全部20 mL稀释备用液（8.1）过柱， 控制流速在1.0 mL/min以下，依次用水3 mL，5 %甲醇溶液（5.5）3 mL淋洗，抽干，用甲醇3 mL洗脱，收 集洗脱液，35 ℃水浴中氮气吹干，加入乙腈甲酸溶液（5.7）1.00 mL，超声2 min、涡旋60 s使残余物溶 解，溶液经微孔滤膜（5.14）过滤，上机测定。 8.3 基质匹配混合标准曲线的制备 称取空白试样约2 g（精确至0.01 g），按照8.1、8.2步骤与试样同法操作，氮气吹干后分别加入1.00 mL混合系列标准工作溶液（5.12），溶解后经微孔滤膜（5.14）过滤，制成2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL的基质匹配系列标准溶液，用液相色谱—串联质谱仪测定。以特征离子 质量色谱峰面积为纵坐标、标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。 8.4 液相色谱-质谱参考条件 8.4.1 液相色谱参考条件 色谱柱：C18柱，柱长50 mm，内径2.1 mm，粒度1.7 m，或性能相当者。 柱温：35 ℃。 进样量：5 L。 流动相：A：0.1 %甲酸溶液（5.6）；B：0.1 %甲酸甲醇溶液（5.8），梯度洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 时间 min 流速 mL/min A % B % 0.0 0.3 95 5 2.0 0.3 85 15 5.0 0.3 60 40 7.0 0.3 5 95 7.1 0.3 95 5 11.0 0.3 95 5 8.4.2 质谱参考条件 离子化模式：电喷雾离子源（ESI），正离子多反应监测模式（MRM）。 喷雾电压：1.0 kV。 源温：150 ℃。 雾化温度：450 ℃。 雾化气流速：1 000 L/h。 锥孔气流速：30 L/h。 碰撞气：氩气。 定性、定量离子对及锥孔电压和碰撞能量参考值见表2。 表2 定性、定量离子对及锥孔电压和碰撞能量参考条件 名称 氟甲喹 定性离子对 m/z 262.1＞244.1 262.1＞108.1 定量离子对 m/z 262.1＞244.1 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 56 16 56 30 保留时间 min 6.26 3 DB33/T 2482—2022 表2（续） 名称 恶喹酸 诺氟沙星 依诺沙星 环丙沙星 培氟沙星 洛美沙星 达氟沙星 恩诺沙星 氧氟沙星 马波沙星 沙拉沙星 司帕沙星 奥比沙星 双氟沙星 定性离子对 m/z 262.1＞244.0 262.1＞216.0 320.2＞302.1 320.2＞276.2 321.2＞303.1 321.2＞232.2 332.2＞314.1 332.2＞288.1 334.3＞316.1 334.3＞290.2 352.2＞265.1 352.2＞308.1 358.2＞340.1 358.2＞314.2 360.3＞316.1 360.3＞245.1 362.2＞318.1 362.2＞261.2 363.3＞320.1 363.3＞345.1 386.2＞342.1 386.2＞299.1 393.3＞349.2 393.3＞292.1 396.2＞352.1 396.2＞295.1 400.2＞356.1 400.2＞299.1 定量离子对 m/z 262.1＞244.1 320.2＞302.1 321.2＞303.1 332.2＞314.1 334.3＞316.1 352.2＞265.1 358.2＞340.1 360.3＞316.1 362.2＞318.1 363.3＞320.1 386.2＞342.1 393.3＞349.2 396.2＞352.1 400.2＞356.1 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 56 17 56 27 56 18 56 16 56 18 56 32 56 19 56 16 56 18 56 16 56 21 56 16 56 22 56 16 56 18 56 25 56 18 56 26 56 14 56 17 56 17 56 26 56 18 56 23 56 17 56 24 56 18 56 28 保留时