ICS 65.020.30 CCS B 41 41 河 南 省 地 方 标 准 DB41/T 2067—2020 奶牛场布鲁氏菌病净化技术规范 2020 - 12 - 30 发布 2021 - 03 - 30 实施 河南省市场监督管理局 发 布 DB41/T 2067—2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由河南省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：新乡市动物疫病预防控制中心、河南科技学院、河南省动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：荆汝顶、秦保亮、李春艳、杜海燕、王英华、冯春花、朱方兵、马健、牛可可、 孙照霞、王超、胡元春、郝晓鹏、姜金庆、刘长忠、常卫波、赵智灿、李磊。 I DB41/T 2067—2020 奶牛场布鲁氏菌病净化技术规范 1 范围 本文件规定了奶牛场布鲁氏菌病的诊断、净化、维持、生物安全与防护等要求。 本文件适用于独立封闭饲养规模100头以上奶牛场布鲁氏菌病的净化。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 18646—2018 动物布鲁氏菌病诊断技术 中华人民共和国农业部.布鲁氏菌病防治技术规范.2007 中华人民共和国农业农村部.跨省调运乳用种用动物产地检疫规程.2019 中华人民共和国农业部.病死及病害动物无害化处理技术规范.2017 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 布鲁氏菌病 由布鲁氏菌属细菌引起的人兽共患传染病。 3.2 布鲁氏菌病净化 对奶牛场采取一系列防控措施，用血清学检测血清均为阴性，奶牛场连续2年无个体发病和无感染 状态，即达到布鲁氏菌净化标准。 4 诊断 4.1 临床诊断 4.1.1 流行特点 布鲁氏菌病（以下简称“布病”）是由布鲁氏菌引起的一种细胞内寄生疾病，主要侵害动物的淋巴 系统和生殖系统。病畜主要通过流产物、精液和乳汁排菌，污染环境。母畜比公畜，成年畜比幼年畜发 病多。在母畜中，第一次妊娠母畜发病较多。带菌动物，尤其是病畜的流产胎儿、胎衣是主要传染源。 消化道、呼吸道、生殖道是主要的感染途径，也可通过损伤的皮肤、黏膜等感染。常呈地方性流行。 4.1.2 临床症状 潜伏期一般为14 d～180 d。最显著症状是怀孕母畜发生流产，流产后可能发生胎衣滞留和子宫内 膜炎，从阴道流出污秽不洁、恶臭的分泌物。新发病的畜群流产较多；老疫区畜群发生流产的较少，但 1 DB41/T 2067—2020 发生子宫内膜炎、乳房炎、关节炎、胎衣滞留、久配不孕的较多。公畜往往发生睾丸炎、附睾炎或关节 炎。 4.1.3 剖检病变 警示——对本病疑似病例剖检采样过程中应当严格按照相关生物安全要求，防止病原微生物扩散及 人员感染。 主要病变为生殖器官的炎性坏死，脾、淋巴结、肝、肾等器官形成特征性肉芽肿（布病结节）。有 的可见关节炎。胎儿主要呈败血症病变，浆膜和黏膜有出血点和出血斑，皮下结缔组织发生浆液性、出 血性炎症。 4.2 实验室诊断 4.2.1 血清学诊断 4.2.1.1 4.2.1.2 4.2.1.3 4.2.1.4 4.2.1.5 4.2.1.6 虎红平板凝集试验（RBT）（按 GB/T 18646—2018 规定） 乳牛全乳环状试验(MRT)（按 GB/T 18646—2018 规定） 试管凝集试验(SAT)（按 GB/T 18646—2018 规定） 补体结合试验(CFT)（按 GB/T 18646—2018 规定） 间接酶联免疫吸附试验（iELISA）（按 GB/T 18646—2018 规定） 竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）（按 GB/T 18646—2018 规定） 4.2.2 病原学诊断 警示——以下病原学操作包括但不仅限于涂片染色镜检、分离培养、聚合酶链式反应（PCR）检测 中涉及细菌活菌操作等，均应在BSL-3级生物安全实验室内进行，操作人员应采取针对性防护措施。 4.2.2.1 涂片染色镜检 按《布鲁氏菌病防治技术规范》要求采集流产胎衣、绒毛膜水肿液、肝、脾、 淋巴结、胎儿胃内容物等组织，按 GB/T 18646—2018 规定制成抹片，布鲁氏菌体染成红色球杆状小杆 菌，而其它菌为蓝色。 4.2.2.2 分离培养 按《布鲁氏菌病防治技术规范》要求，新鲜病料可用胰蛋白琼脂面或血液琼脂斜 面、肝汤琼脂斜面、3%甘油 0.5%葡萄糖肝汤琼脂斜面等培养基培养；若为陈旧病料或污染病料，可用 选择性培养基培养。组织样品、阴道冲洗液、精液、关节液、胃内容物、乳样按 GB/T 18646—2018 规 定处理， 每份样品均一式两份，分别置于普通培养箱和 5%～10%二氧化碳培养箱中，37℃培养 3 d～10 d。 4.2.2.3 聚合酶链式反应（PCR）检测 主要包括普通 PCR 和荧光定量 PCR，普通 PCR 操作方法按 GB/T 18646—2018 第 4 章 13 节布鲁氏菌 Bruce-Ladder 检测方法操作，荧光定量 PCR 可按商品化试剂盒操作。 4.3 结果判定 4.3.1 具有 4.1 时，判定为疑似病例。 4.3.2 符合 4.1，且 4.2.1.1 或 4.2.1.2 阳性时，判定为患病奶牛。 4.3.3 未免疫场奶牛的结果判定如下： a) 4.2.1.1 或 4.2.1.2 或 4.2.1.5 阳性时，判定为疑似患病奶牛； b) 4.2.1.3 或 4.2.1.4 或 4.2.1.6 或 4.2.2 诊断阳性时，判定为患病奶牛； c) 符合疑似患病奶牛但 4.2.1.3 或 4.2.1.4 或 4.2.1.6 阴性时， 30 d 后应重新采样检测，4.2.1.1 或 4.2.1.3 或 4.2.1.4 或 4.2.1.6 阳性的判定为患病奶牛。 4.3.4 免疫场动物的结果判定如下： a) 开展奶牛场布鲁氏菌病净化应连续两年以上未进行布病疫苗免疫； b) 免疫场奶牛最后一次布病疫苗免疫后间隔二年后，按照 4.3.3 进行判定； 2 DB41/T 2067—2020 c) 对免疫背景不清的奶牛场，具有 4.1 时，按照 4.2.2.3 普通 PCR 进行毒株鉴别，田间流行毒 株检测阳性的按患病动物处置。 5 净化 5.1 净化要求 以奶牛场为单位，连续2年无临床病例，且按4.2.1血清学监测结果连续1年以上无阳性。 5.2 技术路线 按照检测、隔离、扑杀相结合的策略，对奶牛场进行净化；疑似病例一旦确诊为布病阳性牛，直接 扑杀；同栏疑似病例及阴性牛群分别进行隔离观察，间隔3个月后按4.2.1进行血清学检测，检测结果仍 为阳性者进行扑杀，同时加强消毒和提高综合饲养管理水平等措施，提高布病净化工作效果。 5.3 净化过程 5.3.1 犊牛检测、隔离、扑杀 犊牛于20日龄时采用4.2.1.1琥红平板凝集试验（RBT）或4.2.1.5间接酶联免疫吸附试验（iELISA） 进行第一次普检，100～120日龄时，进行第二次普检。对检出阳性牛隔离并采用4.2.1.3试管凝集试验 (SAT)或4.2.1.6竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）进行复核，对确诊阳性畜进行扑杀；间隔3个月再次 普检，扑杀确诊阳性牛。阴性牛参照假定健康牛群管理。 5.3.2 布病疑似牛群检测、隔离、扑杀 采用4.2.1.1琥红平板凝集试验（RBT）或4.2.1.5间接酶联免疫吸附试验（iELISA）对污染牛群进 行普检，以后每间隔3个月进行1次普检，对检出阳性牛隔离并采用4.2.1.3试管凝集试验(SAT)或4.2.1.6 竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）进行复核，对确诊阳性牛进行扑杀，直至全部阴性。 5.3.3 假定健康牛群检测 每年春、秋两季各进行一次普检，采用4.2.1.1琥红平板凝集试验（RBT）或4.2.1.5间接酶联免疫 吸附试验（iELISA）初筛，疑似阳性牛按5.3.2进行处置管理。 5.3.4 持续监测 5.3.4.1 连续 2 次以上试管凝集试验(SAT)或竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）检测结果均阴性的畜群 为布病净化畜群，否则按照净化步骤循环进行。 5.3.4.2 每次样品的采集、检测、阳性牛的处理均应在 10 天内完成。 5.3.4.3 净化畜群建立后，每 6 个月按全群 20%的比例采集血清样品进行 1 次抗体监测，以持续维持 净化畜群的健康状态。 5.3.4.4 按照《跨省调运乳用种用动物产地检疫规程》进行检疫，奶牛引入必须来自于非疫区，调入 后应隔离饲养 45 d，经当地动物防疫监督机构检疫合格后，方可混群饲养。 6 生物安全与防护 6.1 人员防护 6.1.1 采样人员防护 3 DB41/T 2067—2020 采样前，采样人员需佩戴一次性医用乳胶手套、口罩、帽子、鞋套，着工作服，必要时佩戴护目镜。 对采样器械进行消毒。采样结束后，收集采样物品进行消毒处理，并更换衣服清洗消毒。 6.1.2 检测人员防护 应在符合相应级别生物安全实验室中操作，病原分离培养需在BSL-3级实验室操作，未经培养的感 染性材料和灭活性实验在BSL-2级实验室操作。检测人员需佩戴一次性医用乳胶手套、口罩、帽子、鞋 套，着工作服、护目镜。 6.1.3 饲养人员防护 进入圈舍佩戴口罩、穿工作服、胶鞋等必备的防护用品，避免破损皮肤接触牲畜的排泄物、分泌物。 犊牛助产和处理流产胎儿、死胎儿时，除备有工作服、橡皮围裙、帽子、口罩和胶鞋外，还应戴乳胶手 套和长袖橡胶手套，备有接羔袋和消毒液，禁止赤手接触流产胎儿，接产后进行自身清洗消毒。 6.2 环境消毒 6.2.1 地面消毒 采用氢氧化钠和生石灰等碱类消毒剂。用2%氢氧化钠水溶液，喷洒6 h～12 h后用清水冲洗干净， 生石灰应加等重量的水，均匀洒布于需消毒场所。 6.2.2 圈舍消毒 可选用2%烧碱等有效消毒药进行喷洒消毒。 6.2.3 设施工具消毒 对金属设施、设备采取火焰、熏蒸等方式消毒。 对运输病畜的车辆和其它工具选用过氧乙酸、次氯酸、二氧化氯等消毒剂进行喷洒消毒。 6.3 病死动物处理 6.3.1 家畜的流产胎儿、胎盘、胎衣或死胎等，采取深埋或焚烧等方法进行无害化处理；流产死胎落 下和被羊水污染的场地，用 2%氢氧化钠浸透垫草和地面。 6.3.2 从畜群中检出并剔除布鲁氏菌病畜后，应对畜舍、用具及运动场所等进行紧急消毒；按照《病 死及病害动物无害化处理技术规范》的要求，对病死和扑杀的病畜进行无害化处理。 4