ICS 65.020.20 DB23 B 05 黑 龙 江 省 地 方 标 准 DB23/T 2525—2019 主要肥效微生物筛选技术规程 2019-12-13 发布 黑龙江省市场监督管理局 2020-01-12 实施 发 布 DB23/T 2525—2019 前  言 本标准依据 GB/T 1.1的编写规则起草。 本标准由黑龙江省农业农村厅提出。 本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。 本标准由黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所和哈尔滨市芮煊科技有限公司起草。 本标准主要起草人：王爽、赵晓宇、李伟群、陈雪丽、万书明、孙磊、姜辉、王晓军、张磊、常本 超。 I DB23/T 2525—2019 主要肥效微生物筛选技术规程 1 范围 本标准规定了主要肥效微生物筛选技术的术语和定义，样品采集，肥效微生物的筛选及保藏。 本标准适用于根瘤菌、溶磷菌和解钾菌三种肥效微生物的筛选。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 889-2004 土壤速效钾和缓效钾含量的测定 LY/T 1232-2015 森林土壤全磷的测定 SN/T 2632 微生物菌种常规保藏技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肥效微生物 从自然界分离筛选，通过自身代谢活动产生固氮、溶磷、解钾等功能，使植物获得特定肥料效应， 并可用于微生物肥料生产的微生物。本标准中的肥料微生物主要指根瘤菌、溶磷菌和解钾菌。 3.2 透明圈 在琼脂平板上，溶磷菌在培养过程中分泌有机酸，将培养基中不透明的难溶磷酸钙溶解后形成的透 明区。 4 样品采集 4.1 主要用具 铁锹、小铲、镊子、GPS 定位仪、记号笔、装土袋子（布袋）、塑料袋、剪子、标签纸、冰盒、75% 酒精、吸水纸、变色硅胶离心管。 4.2 根瘤样品采集 4.2.1 采样时间 选择豆科作物盛花期采集根瘤。 4.2.2 采样方法 1 DB23/T 2525—2019 视土壤水分、通气状况和植株大小决定植物根系的挖掘深度，将整株植物的根系挖出，轻轻敲掉根 系周围大的土块，然后将根放入塑料袋中，贴好标签带回实验室。 4.2.3 根瘤样品的保存 轻轻抖去根系上的土壤，将根在水中浸泡、洗净、晾干或用吸水纸吸干。用剪刀将主根上个大、粉 红色的瘤子（带点根）小心剪下，保存于盛有干燥剂（采用变色硅胶）的 5mL 的离心管中，置于 4℃条 件下冷藏存放，每天对保存物进行检查，发现硅胶由蓝色完全变为红色时，应及时转移到新管子中。在 15d 内完成根瘤菌的分离工作。 4.3 土壤样品采集 4.3.1 采样时间 溶磷、解钾微生物来源的土壤样品采集可在植物生长的整个过程中进行。 4.3.2 采样方法 去掉地表大块沙石和其他杂物。根际土壤，用干净铁锹或小铲沿植物周围往下挖，尽量将整株植物 的根系挖出，轻轻敲掉根系周围大的土块，然后将根放入塑料袋中，将根上土抖下或用手从塑料袋外从 根上撵下，贴上标签，封口，同时在塑料封口袋上写清采样编号，放入冰盒带回实验室处理。根围土壤， 采样深度一般是 0cm～30cm 土层，需记录采取土样的深度（cm）和距离植株根系的距离（cm），沿植物 外 10cm 周围往下挖 5cm～20cm 的土壤，在植物周围对称采集 5 个点的土壤样本。然后放入塑料袋中， 贴上标签，封口，同时在塑料封口袋上写清采样编号，放入冰盒带回实验室处理。采集不同采样点前需 将工具上的残土清理干净。 5 肥效微生物的筛选 5.1 根瘤菌的筛选 5.1.1 根瘤菌的分离 4.2.3中的保存的根瘤样品用95%乙醇浸泡根瘤30s，无菌水清洗3次～4次，再用0.1%升汞（氯化汞） 浸泡根瘤5min，再用无菌水冲洗根瘤4次～5次。在无菌环境下用无菌刀片切开根瘤，用无菌镊子夹取根 瘤，使横断面接触配置好的YMA培养基（配置方法见附录A1）斜面或平板表面，并将根瘤内汁液涂布于 培养基表面，在试管或培养皿表面写好编号，放在25℃～28℃恒温培养箱中倒置培养，在20d内每天观 察，视菌落生长情况决定培养时间。 5.1.2 根瘤菌的纯化 事先准备好无菌的带玻璃珠加水的试管或离心管一支，在无菌环境下从试管或平板上长出的乳白 色、凸起菌落挑出一接种环入管内水中，在振荡器上振荡1min，使菌苔充分分散成菌悬液，取一环菌液 在YMA固体培养基上划线接种，平板放在25℃～28℃恒温培养箱中倒置培养。待菌落长出后，挑取乳白 色、凸起的菌落反复划线3次以上获得纯菌落。 5.1.3 根瘤菌结瘤能力的验证 可选用如下三种方法之一进行根瘤菌的回接结瘤实验： 2 DB23/T 2525—2019 a）水培法：培养基质为微氮培养液，其配方见附录A6和A7，按照附录B1的步骤完成根瘤菌结瘤能 力的验证。 b）砂培法：培养基质为加入微氮培养液的石英砂，按照附录B2的步骤完成根瘤菌结瘤能力的验证。 c）土培法：培养基质为灭菌土壤，按照附录B3的步骤完成根瘤菌结瘤能力的验证。 观察各植株根部结瘤情况，记录植株株高（cm）、主根和侧根的瘤数（个/株）、主根和侧根瘤重 （g/株）、地上部鲜重（g/株）。 5.2 5.2.1 溶磷、解钾菌的筛选 溶磷、解钾菌的分离 称取土样10g，置于装有无菌玻璃珠的三角瓶中，分离溶磷菌应加入90mL无菌水，分离解钾菌应加 入0.85%NaCl溶液。常温下以160rpm/min的转速振荡20min，制成均匀的土壤悬液。采用10倍稀释法依次 -1 -6 -4 -5 -6 配制10 ～10 的浓度梯度样液，选取10 、10 、10 3个浓度梯度的样液。分离解磷菌时，每次每个浓 度样液吸取0.1mL，涂布于PKO无机磷（附录A2）和蒙金娜有机磷（附录A3）固体培养基平板上，每个稀 释度设3个重复，30℃培养箱中倒置培养7d；分离解钾菌时，每次每个浓度样液吸取0.1mL，涂布于解钾 菌筛选培养基（附录A4）平板上，每个稀释度设3个重复，28℃培养箱中倒置培养3d～4d。 5.2.2 溶磷、解钾菌的纯化 挑取每个梯度的平板上有透明圈的菌落，并用1，2，3，4...来标注，测量透明圈直径（D）、菌落 直径（d），根据是否产生透明圈以及D/d值大小来初步确定菌株的溶磷解钾能力的强弱。判定标准如下： 解磷（钾）效果弱：0＜D/d＜1.0 解磷（钾）效果中等：1.0≤D/d＜1.5 解磷（钾）效果较强：1.5≤D/d＜3.0 解磷（钾）效果强：D/d≥3.0 将D/d≥1.5的菌落利用平板划线法分离纯化后，再用接种针挑取有明显透明圈的菌落，进一步通过 平板划线法纯化，直至得到纯菌株后，转到牛肉膏蛋白胨斜面培养基（附录A5）上，保存于4℃冰箱中。 5.2.3 溶磷能力的测定 在500mL三角瓶中分别装入100mL的PKO无机磷液体培养基（附录A2无琼脂）和100mL蒙金娜有机磷液 体培养基（附录A3无琼脂），121℃高压灭菌30min后备用。然后将溶磷圈法初筛得到的菌株接种到牛肉 膏蛋白胨斜面培养基上，于28℃培养24h，挑取细菌接入到无菌水中，制成含菌量107个/mL的菌悬液， 取1mL菌悬液，分别对应接种至PKO无机磷液体培养基和100mL蒙金娜有机磷液体培养基，以培养基中加 入1mL无菌水作为对照，每个处理3次重复，振荡培养（28℃，150rpm/min）5d。然后在4℃条件下对培 养液进行离心（4000rpm/min）15min，吸取上清液，按照LY/T 1232-2015中4有效磷的测定方法测定上 清液可溶性磷含量。 5.2.4 解钾能力的测定 将在三角瓶中培养好的解钾细菌发酵液倒出，从中定容50mL，将发酵液在500rpm/min下离心10min， 除去发酵液中的不溶性物质，然后取10mL菌液10000rpm/min离心10min，上清液中的钾含量测定按照NY/T 889-2004中3.1的规定测定速效钾含量。测定菌体钾含量之前，先将菌体与残渣经碾钵充分撵磨，用10mL 去离子水浸提，再用移液管吸取4mL上清液与4mL 6mmol/L的LiCl充分混匀，按照NY/T 889-2004中3.1 的规定测定速效钾含量。 6 肥效微生物的保藏 3 DB23/T 2525—2019 6.1 根瘤菌的保藏 挑取结瘤能力强的根瘤菌进行保藏，按照SN/T 2632的规定进行。 6.2 溶磷、解钾微生物的保藏 挑选生长旺盛、具有较大溶磷、解钾圈的菌株进行保藏，按照SN/T 2632的规定进行。 4 DB23/T 2525—2019 附录A（规范性附录） 培养基配方及缓冲液 A1 YMA 培养基 甘露醇，10.0g；酵母粉，0.8g；K2HPO4，0.25g；KH2PO4，0.25g；MgSO4·7H2O，0.2g；NaCl，0.1g； 0.25%溴麝香草酚蓝（仅在从根瘤中分离根瘤菌时选择性的加入），1ml；琼脂，15g～18g；蒸馏水，1000ml； pH 值，6.8～7.0。 A2 PKO 无机磷培养基 葡萄糖，10g；Ca3(PO4)2，5g；(NH4)SO4 0.5g；NaCl，0.2g；KCl，0.2g；MgSO4·7H2O，0.3g；MnSO4·4H2O， 0.03g；FeSO4·7H2O，0.03g；酵母膏，0.5g；琼脂，15g～20g；蒸馏水，1000mL；pH 值，6.8～7.0。 A3 蒙金娜有机磷培养基 葡萄糖，10g；(NH4)SO4，0.5g；NaCl，0.3g；KCl，0.3g；FeSO4·7H2O，0.03g；MnSO4·4H2O，0.03g； 卵磷脂，0.2g；CaCO3，5g；酵母膏，0.4g；琼脂，15g～20g；蒸馏水，1000mL；pH 值，7.0～7.2。 A4 解钾菌筛选培养基 蔗糖，5g；Na2HPO4，2g；MgSO4·7H2O，0.5g；FeCl3,0.005g；CaCO3，0.1g；钾长石粉，1g（过 100 目筛后无菌水浸泡 3d，除去水溶性钾），琼脂，18g～20g；蒸馏水，1000mL；pH 值，7.0～7.5。 A5 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏，3g；蛋白胨，5g；琼脂 18g～20g；蒸馏水，1000mL；pH 值，7.0～7.2。 A6 液体微氮培养基 Ca(NO3)2·4H2O，0.03g；CaSO4，0.46g；KCl，0.075g；MgSO4·7H2O，0.06g；K2HPO4，0.136g；柠檬酸 铁，0.075g；微量元素，1mL；蒸馏水，1000mL。 A7 微量元素 H3BO3，2.86g；Mn