ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 445—2019 代替 DB15/ 445-2008 科尔沁尖叶胡枝子认定技术规程 Technical Guideline for Certification of Lespedeza hedysaroides（Pall.）Kitag. cv. Keerqin 2019-11-14 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-12-14 实施 发 布 DB15/T 445—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替DB15/ 445—2008《科尔沁尖叶胡枝子认定技术规程》。与DB15/ 445—2008 相比，， 除编辑性修改外主要技术变化如下： ——修改了“范围”部分（见第1章）； ——修改了“学名”（见2.2）； ——修改了“品种来源”部分（见第3章）； ——修改了“植物学认定”为“植物学特征认定”（见第4章）； ——在“植物学特征认定”中增加了“幼苗植株”和“成年植株”（见4.1和4.2）； ——修改了“果实”为“荚果”及其内容（见4.2.6，2008年版的4.6）； ——增加了“种子”（见4.2.7）； ——修改了“物候期认定”部分（见第5章，2008年版的第6章）。 本标准由中国农业科学院草原研究所提出。 本标准由内蒙古自治区草原生态修复标准化技术委员会（SAM/TC 34）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院草原研究所、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、内蒙 古农业大学、内蒙古林西县草原工作站。 本标准主要起草人：陶雅、李峰、徐丽君、柳茜、那亚、魏晓斌、赵淑芬。 I DB15/T 445—2019 科尔沁尖叶胡枝子认定技术规程 1 范围 本标准规定了科尔沁尖叶胡枝子的植物学特征认定、幼苗形态认定、物候期认定和 DNA 认定方法。 本标准适用于科尔沁尖叶胡枝子的认定。 2 品种名 2.1 中文名 科尔沁尖叶胡枝子。 2.2 学名 Lespedeza juncea（Linn. f.）Pers. cv. Keerqin。 3 品种来源 科尔沁尖叶胡枝子是由中国农业科学院草原研究所、中国农业大学和内蒙古林西县草原工作站等单 位，采用一次混合选择法，从内蒙古林西县野生尖叶胡枝子(Lespedeza juncea（Linn. f.）Pers. cv. Keerqin)群体中选出的优良单株，经过多年人工栽培驯化而成。2006 年 12 月经全国草品种审定委员会 审定登记为栽培品种（品种登记号：325） 。品种原种由中国农业科学院草原研究所保存。 4 植物学特征认定 4.1 幼苗植株 子叶出土后呈长椭圆形、绿色、肉质，生长缓慢；真叶 4～5 片后生长加快，叶片黄绿色。播种当 年基部不分枝，主枝上分生侧枝较多，株高 30 cm～40 cm。 4.2 成年植株 4.2.1 株型 多年生草本状半灌木，直立，株型呈扫帚状，成熟株高 85 cm～100 cm。 4.2.2 根系 直根系，为表层聚积型，主要分布在20 cm土层内。 4.2.3 枝条 1 年生枝条基部粗 0.5 mm 以下。2 年及 2 年生以上主枝基部粗 1.3 mm～3.5 mm，分枝为 2～7 个； 主枝中下部侧枝较多，为 15～58 个，长度 25 cm～48 cm，与主枝呈 25°～35°夹角。 1 DB15/T 445—2019 4.2.4 叶片 羽状3出复叶，个别植株羽状4～5出复叶，托叶刺芒状，叶片条状长圆形，小而密，开花前叶色呈 黄绿色，花后稍暗。顶生小叶较大，椭圆状或长矩圆状披针形，长20 mm～25 mm，宽6 mm～7 mm。叶脉 伸出呈短刺尖，主叶脉凹陷。 4.2.5 花序 总状花序腋生，长于叶片，每花序 3～5 小花，小花较小，部分小花直接生于叶腋处。总花梗和小 花梗较短。花冠蝶形白色，旗瓣中央和龙骨瓣顶端为紫色。萼浅杯状，披针形，顶端渐尖，较萼筒长。 4.2.6 荚果 荚果包于萼内，倒卵形或椭圆形，先端有宿存花柱，伏生白柔毛，腹缝线略长于背缝线，内含1粒 种子。 4.2.7 种子 种子椭圆形或卵形，黄色、紫色或具紫色、淡紫色斑纹，千粒重1.57 g～1.84 g。 5 物候期认定 在内蒙古自治区赤峰市林西县地区 5 月下旬播种，6 月初出苗，20 d 左右苗齐，6 月下旬至 7 月上 旬进入分枝期，8 月上旬现蕾，中下旬少量开花，8 月下旬至 9 月上旬有少量植株结实，9 月中旬少数 种子成熟。翌年，5 月初开始萌动、下旬返青，6 月中下旬开始现蕾，7 月下旬至 8 月上旬为开花期，8 月下旬至 9 月初进入荚果期，9 月中下旬种子成熟。生育期 115 d～120 d。 6 DNA 认定 6.1 实验仪器 PCR扩增仪；电泳仪；紫外分光光度计；多通道分子成像系统。 6.2 取样与保存 在开花期分单株采集嫩叶，样品置于液氮中，于实验室-20 ℃保存。 6.3 DNA 提取 用DNA提取试剂盒提取总DNA，0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。 6.4 ISSR 反应体系及程序 6.4.1 ISSR 反应体系 总体积20 µL，含有约40 ng基因组DNA，0.2 µmol/L引物（表1），10 µL 2×Taq PCR MasterMix[0.1U µ/LTaq Polymerase，500 µM dNTP each ，20 mM Tris-HCl(pH8.3)，100 mM KCl，3 mM MgC12)]，用 ddH2O补充体积至20 µL。 2 DB15/T 445—2019 6.4.2 PCR 扩增程序 94 ℃充分变性 5 min，然后进行 35 个循环：94 ℃变性 30 s，50 ℃或 52 ℃(根据引物而定)退火 45 s，72 ℃延伸 1.5 min，最后 72 ℃延伸 7 min，4 ℃终止反应见表 1。PCR 产物在 0.8 %琼脂糖凝胶 上电泳分离，核酸染料染色显带，多通道分子成像系统成像并观察。 表1 所用的 ISSR 引物序列和退火温度 退火温度 引 物 序 列 UBC-812 (GA)8A 50 UBC-809 (AG)8G 52 UBC-811 (GA)8C 52 UBC-825 (AC)8T 52 UBC-827 (AC)8G 50 UBC-880 (GGAGA)3 50 UBC-842 (GA)8YG 52 UBC-824 (TC)8G 50 ℃ 注：Y=C/T. 6.5 特异条带 用 UBC-880 引物或者扩增后，在 500 bp～600 bp 处出现一清晰明显的特异条带。 _________________________________ 3