ICS 65.150 B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2467—2018 鲫疱疹病毒 II 型病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 四川省质量技术监督局 2018 - 05 - 01 实施 发 布 1 DB51/T 2467—2018 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 试剂和材料 ........................................................................ 2 5 设备和器械 ........................................................................ 2 6 临床检查 .......................................................................... 2 7 实验室样品采集 .................................................................... 2 8 病毒的分离 ........................................................................ 2 9 病毒鉴定 .......................................................................... 3 10 综合判定 ......................................................................... 4 附录 A（规范性附录） 试 剂 附录 B（资料性附录） CyHV-2 配 方 .................................................. 5 解旋酶基因参考序列（1446bp） ............................ 6 I DB51/T 2467—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、余泽辉、陈德芳、邓梦玲、黄小丽、欧阳萍、郑李平。 II DB51/T 2467—2018 鲫疱疹病毒 II 型病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鲫疱疹病毒II型病诊断的术语与定义、试剂和材料、临床检查、实验室样品采集、病 毒分离、病毒鉴定和综合判定等技术规程。 本标准适用于鲫（Carassius auratus）与金鱼疱疹病毒II型病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 鲫疱疹病毒 II 型 Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2 是一种感染鲫鱼及其变种（金鱼、异育银鲫与彩鲫等）的高致病性病毒，又称金鱼造血器官坏死病 毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV）或疱疹病毒性造血器官坏死病病毒（Herpesviral haematopoietic necrosis virus, HVHNV）。 3.2 巢氏 PCR Nested Polymerase Chain Reaction 巢氏聚合酶链氏反应。 3.3 CPE Cytopathic effect 细胞病变效应。 3.4 GFF Goldenfish fin 金鱼鳍细胞系。 1 DB51/T 2467—2018 4 试剂和材料 4.1 水 用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 4.2 试剂与培养基 按 GB/T 4789.28 与 SC/T 7014 规定执行，金鱼鳍细胞系（GFF）、小牛血清（FBS）、M199营养 液、青霉素、链霉素。Taq酶、dNTPs、Mix-reaction buffer、DNA分子量标准参照物（1000bp DNA Maker） 与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录A。 4.3 巢氏 PCR 引物 DNA 解 旋 酶 基 因 巢 氏 PCR 扩 增 引 物 外 ， P1-F ： 5’-TGAAATGTCAAAAGTGGATGG-3’ ， P1-R ： 5’-TATTCCCAGACAGCCTTCAAA-3’，扩增片段大小716bp； 内引物，P2-F：5’-GAACACCGCTGCTCATCATC-3’，P2-R：5’-ACTCTTCGCAAGTCCTCACC-3’，扩增片段大 小357bp。 - 20℃保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子和手术刀、组织匀浆器、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌锅、超净工作 台、一次性滤器（0.22μm）、普通冰箱、超低温冰箱、倒置显微镜、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR 扩增仪、水平电泳系统、凝胶成像系统与CO2培养箱等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼离群独游，摄食减少或停止摄食，常在池塘边呈浮头状缓慢游动。 6.2 外部检查 病鱼体表出血，尤其以口、鳃盖、眼球周围、下颌、鳍条基部最为明显；部分病鱼腹部膨大，眼球 突出。 6.3 剖检 鳃明显充血、出血，呈现典型“大红鳃”，或腐烂坏死；肝、肾肿大、出血；脾肿大，发黑。部分 病鱼鳃丝苍白，鳔壁瘀斑状出血。 7 实验室样品采集 样品采集按 GB/T 18088 与 SC/T 7103 执行。 8 病毒的分离 2 DB51/T 2467—2018 8.1 样品处理 应在10°C以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆，再用细胞培养液PBS缓冲液(A.1)按1:10的最终稀 释度组织悬液，加入100IU/mL双抗（青霉素、链霉素A.2）后，置4°C冰箱作用1-2h后，反复冻融3次， 用0.22μm的一次性滤器过滤除菌，滤液保存于﹣20℃或以下温度冷冻保存。 8.2 细胞接种与观察 将上述滤液用细胞培养液(A.3)再做两次10倍稀释，然后将这1:10、1:100、1:1000三种稀释度的滤 液，分别接种到生长24-48h的GFF单层细胞，按每2cm2的细胞单层接种100μL，的中，25°C吸附1-2h后弃 病毒液，然后加含2% FBS和100IU/ml双抗的M199细胞培养维持营养液(A.4)，置于25°C培养。 接种滤液后的细胞，7d内每天每天用倒置显微镜观察CPE出现情况。典型的CPE为细胞空泡、变圆、 脱落。若细胞出现CPE，收集细胞液进行鉴定。若细胞在接毒后7d未出现CPE，盲传一次，再培养观察7d， 未出现CPE的样品则可判定为阴性。 9 病毒鉴定 9.1 样品处理 对有临床症状的病鱼，按8.1的要求取样匀浆后取50mg-100mg于1.5ml EP管中；对出现CPE的细胞培 养样品取450μL于1.5ml EP管中。用CyHV-2核酸作为阳性对照，无感染CyHV-2鲫鱼正常组织或无病毒感 染的细胞培养物为阴性对照，用等体积的双蒸水作为空白对照。 9.2 DNA 提取 DNA提取可使用商品化的组织病毒DNA抽提试剂盒(按说明书操作)，或使用传统酚-氯仿提取法，具 体操作如下（传统法）： a) 将样品置于-40℃冰箱反复冻融 3 次，12000r×5min。 b) 取上清 400μl，加入 500ul tris-饱和酚，充分混合，静置 5min，12000r×5min，4 ℃。 c) 取上清加入饱和酚，氯仿各 200μl，混匀，静置 5min，12000r×5min，4℃。重复一次。 d) 取上清加入 200μl 氯仿，混匀，12000r×5min，4℃，此时将出现分层。如果中层蛋白多，则 重复上一步骤。 e) 取上清加 1-2 倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置 20min，12000r×5min，4℃。 f) 弃上清，用 75%酒精洗涤，12000r×5min，4℃，重复操作一次。 g) 弃上清，操作台中自然晾干后，20-30μlTE 溶解沉淀，-20℃保存，备用。 9.3 巢氏 PCR 扩增反应 分两步进行，先使用外引物P1-F和P1-R进行PCR扩增，将获得的PCR产物为模板使用内引物P2-F和 P2-R进行二次扩增。 9.3.1 第一次 PCR 扩增反应 反应体系：12.5μL Mix-reaction buffer，P1-F和P1-R各 1μL（10μmol/L），DNA模板2μL，无菌 双蒸水补足体积至25μL。混匀后，3000r/min离心30s。 反应条件：94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C 退火30s，72°C 延伸40s，循环30次，最后在72°C 延伸10min。 3 DB51/T 2467—2018 9.3.2 第二次 PCR 扩增反应 反应体系：12.5μL Mix-reaction buffer，P2-F和P2-R引物各 1μL（10umol/L），取1μL第一次PCR 产物为模板，无菌双蒸水补足体积至25μL。混匀后，3000r/min离心30s。 反应条件：同第一次PCR