ICS 13.100 C 75 DB 12 天 津 市 地 方 标 准 DB 12/ T465—2012 预防性健康检查 粪便中沙门氏菌、 志贺氏菌的检测方法 Detection methods of Salmonella and Shigella who need to pass preventive health check 2012 - 11 - 14 发布 天津市质量技术监督局 2013 - 02 - 15 实施 发 布 DB 12/ T465—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的标准文本的格式和文字 进行编写。 本标准由天津市南开区疾病预防控制中心提出。 本标准起草单位：天津市南开区疾病预防控制中心、天津正大乾坤生物科技有限公司。 本标准主要起草人：柳光斌、陈金枝、庞作章、马均彪、王 楠、于 磊、沈宗林。 I DB 12/ T465—2012 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到6.1.2条采便管与微生物采样增菌培 养管内容的采便套管和采便棒相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联 系方式获得： 专利持有人姓名：马均彪 地址：天津市南开区东马路新安花园A-1-604 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利 的责任。 II DB 12/ T465—2012 预防性健康检查 粪便中沙门氏菌、 1 DB 12/ T465—2012 志贺氏菌的检测方法志贺氏菌的检测方法 1 范围 本标准规定了预防性健康检查 粪便中沙门氏菌、志贺氏菌的检测方法的术语和定义、设备和实验 器具、培养基和试剂、检验程序、操作步骤以及结果报告。 本标准适用于疾病预防控制机构和医疗机构对食品、公共场所等行业从业人员，进行沙门氏菌和志 贺氏菌健康带菌者的检测和确认。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 采便管 Collecting pipe 由采便套管和采便棒构成的采便装置，采便套管内装有经钴60辐射灭菌的SN液体增菌液培养基。 2.2 带菌者 Carriers 无任何临床表现，从粪便中分离到沙门氏菌（伤寒和副伤寒菌）或志贺氏菌的人群。 3 设备和实验器具 3.1 冰箱：4℃～8℃。 3.2 恒温培养箱：36℃±1℃。 3.3 电子天平：感量 0.1 g。 3.4 锥形瓶:容量 500 mL，250 mL。 3.5 无菌培养皿：直径 90 mm。 4 培养基和试剂 4.1 沙门氏菌和志贺氏菌增菌液（SN）：见附录 A 中 A.1。 4.2 沙门氏菌、志贺氏菌（SS）琼脂培养基：见附录 A 中 A.2。 4.3 HE 琼脂：见附录 A 中 A.3。 4.4 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录 A 中 A.4。 2 DB 12/ T465—2012 4.5 克氏双糖铁琼脂（KIA）见附录A 中粪便A.5。 4.6 三糖铁（TSI）琼脂：见附录 A 中粪便 A.6。 4.7 动力-吲哚-尿素（MIU）培养基：见附录 A 中 A.7。 4.8 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.8。 4.9 氰化钾 （KCN） 培养基：见附录 A 中 A.9。 4.10 赖氨酸铁琼脂（LIA）：见附录 A 中 A.10。 4.11 糖发酵管：见附录 A 中 A.11。 4.12 邻硝基酚 β-D 半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录 A 中 A.12。 4.13 半固体琼脂：见附录 A 中 A.13。 4.14 丙二酸钠培养基：见附录 A 中 A.14。 4.15 沙门氏菌属 O、H 和 Vi 诊断血清。 4.16 志贺氏菌属诊断血清 5 粪便中沙门氏菌、志贺氏菌的检验程序 沙门氏菌、志贺氏菌的检验程序见图1： 3 DB 12/ T465—2012 粪便采集 接种 SN 增菌液 36℃±1℃ 18h～24h HE 或 XLD 或 SS 琼脂平板和 麦康凯琼脂平板分离 36℃±1℃ 18h～24h 挑取可疑菌落 接种 KIA 或 TSI，及 MIU、LIA 36℃±1℃ 18h～24h 血清学分型 系统生化鉴定 报告 图1 沙门氏菌、志贺氏菌检验程序图 6 操作步骤 6.1 粪便标本采集 6.1.1 肛拭子采便 手持灭菌直肠棉拭子先用无菌生理盐水中浸湿，由肛门插入直肠 3cm～5cm 处，旋 o 转 360 采集后，将棉拭子手持端折断弃去，棉拭子端放入灭菌的 SN 增菌液培养管中。 o 6.1.2 采便管采便 手持采便管中的采便棒由肛门插入直肠3cm～5cm处，旋转360 采集后，将采便棒 放入灭菌的SN增菌液培养管中。 6.1.3 现场留便 体检者在现场自行留取约1g粪便并及时接种灭菌的SN增菌液培养基中。 6.2 增菌 4 DB 12/ T465—2012 将肛拭子采便或采便管采便或自行留便的SN增菌液培养管，置36℃±1℃，培养18h～24h。 6.3 分离 分别用接种环取增菌液一环，划线接种一个HE琼脂平板或XLD琼脂平板或SS琼脂平板和麦康凯琼脂 平板，于36℃±1℃培养18h～24h，观察各个平板上生长的菌落。各个平板上菌落特征见表1。 表1 沙门氏菌属、志贺氏菌在选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性平板 HE 琼脂 XLD 琼脂 SS 琼脂 麦康凯琼脂 沙门氏菌 志贺氏菌 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或 几乎全黑色。 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全 部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 无色透明、半透明。 无色透明、半透明。 无色半透明，产硫化氢菌株菌落中心带黑色。 无色透明、半透明。 无色透明、半透明。 无色透明、半透明。 6.4 初步生化鉴定试验 6.4.1 沙门氏菌（伤寒及副伤寒菌）的初步生化鉴定 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种克氏双糖铁琼脂（KIA）或三糖铁（TSI） 琼脂和动力-吲哚-尿素培养基（MIU）及赖氨酸铁琼脂（LIA），于36℃±1℃，培养18h～24h。沙门氏 菌初步生化鉴定见表2。 表2 沙门氏菌的初步生化鉴定 KIA（TSI） MIU LIA 体 硫 化 氢 A/K － ＋ ＋ － － ＋ ＋ 可疑沙门氏菌属 A/K ＋ －/＋ ＋ － － － － 可疑沙门氏菌属 A/K ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ 可疑沙门氏菌属 A/A ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ 可疑沙门氏菌属 A/K ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ 非沙门氏菌 A/A ＋ ＋ ＋ － － － ＋ 非沙门氏菌 A/K ＋ ＋ ＋ － ＋ － ＋ 非沙门氏菌 A/A ＋ － ＋/－ ＋ － ＋/－ －/＋ 非沙门氏菌 底层/斜面 气 动 吲 尿 力 哚 酶 赖 氨 酸 硫 化 氢 初步判断 注：A：产酸（黄色）；K：不产酸（红色） ；＋：阳性；－：阴性；＋/－：多数阳性；－/＋：多数阴性。 5 DB 12/ T465—2012 6.4.2 志贺氏菌的初步生化鉴定 自选择性分离平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种克氏双糖铁琼脂（KIA）或三糖铁 （TSI）琼脂及动力-吲哚-尿素培养基（MIU）及赖氨酸铁琼脂（LIA）。每份标本应多挑几个菌落， 于36℃±1℃，培养18h～24h。志贺氏菌初步生化鉴定见表3。 表3 志贺氏菌初步的生化鉴定 KIA（TSI） 底层/斜面 A/K 气 体 － ※ MIU 硫 化 氢 － LIA 动 吲 尿 力 哚 酶 － －/＋ － 赖 氨 酸 硫 化 氢 初步判断 － － 可疑志贺氏菌属 注：1、A：产酸（黄色） ；K：不产酸（红色）；＋：阳性；－：阴性；＋/－：多数阳性；－/＋：多数阴性。 ※ 2、 为福氏 6 型的某些生物型、鲍氏 13 及 14 某些生物型产气。 6.5 血清学分型鉴定试验 6.5.1 沙门氏菌血清玻片凝集试验 挑取符合沙门氏菌生化反应的KIA或TSI斜面上菌苔先与A～FO多价血清进行玻片凝集，凝集阳性者 （生理盐水不凝集），再选用O-2、O-4、O-7、O-8、O-9等因子血清凝集，沙门氏菌（伤寒和丙型副伤 寒菌）的Vi抗原能阻碍O抗原凝集，必要时制成浓菌悬液经100℃水浴30min破坏Vi抗原后，再进行抗O 血清的凝集。O抗原确定后再用H因子诊断血清凝集以确定菌型见表4。检出沙门氏菌（伤寒和丙型副伤 寒菌）以外的沙门氏菌时其抗原的鉴定可参见附录B（常见沙门氏菌抗原表）进行鉴定。沙门氏菌（伤 寒和丙型副伤寒菌）具有Vi抗原应与Vi诊断血清进行血清凝集试验。 表4 沙门氏菌型抗原鉴定表 菌种名称 H 抗原 O 抗原 表面抗原 Ⅰ相 Ⅱ相 甲型副伤寒沙门氏菌 2 a － － 乙型副伤寒沙门氏菌 4 b 1,2 － 丙型副伤寒沙门氏菌 7 c 1,5 Vi 伤寒沙门氏菌 9 d － Vi 注： — 表示无此项抗原。 6.5.2 志贺氏菌血清玻片凝集试验 挑取 KIA(TSI)疑似志贺氏菌的培养物，先用志贺氏菌四种多价血清做玻片凝集试验。如呈现 凝集，则用 B 群（福氏）多价、D 群（宋内）血清及志贺 2 型、志贺 1 型分别进行凝集试验。 a) 与 B 群（福氏）多价血清凝集的培养物，则用群 3，4、6、7，8 因子血清进行凝集试验，根据 群因子血清的凝集的结果再选用 1 型～6 型分型血清进行凝集试验，鉴定出型和亚型（见表 6、表 7）。 b) 6 DB 12/ T465—2012 与志贺四种多价血清不凝集的培养物，应用 C 群鲍氏多价血清及 1 型～19 型因子血清进行检 查。若鲍氏血清不凝集，再用 A 群 3 型～15 型多价及分型血清进行检查。 c) 若与上述血清均不凝集应进行生化鉴定，若生化反应符合志贺氏菌定义应注意该菌是否带有 K 抗原，将该菌制成浓菌液 100℃水浴 30min（破坏 K 抗原）,待菌液凉至室温再进行血清学鉴定。 d) e) 若四种多价血清凝集，而不与相应的分